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基础分子服务

服务名称载体构建
服务简介:载体构建是指用体外重组方法将目的序列插入特定载体,形成重组质粒,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,进而进行科学研究的技术。
佰昊生物采用的不依赖于连接酶的克隆(Ligation independent cloning,LIC)是继限制性内切酶/连接酶克隆法后出现的第二代DNA克隆技术,该方法不依赖DNA连接酶作用,克隆过程快速简单,克隆效率高,在蛋白质结构组学和功能组学中应用颇多。佰昊生物可进行包括TA克隆,表达载体、shRNA载体、慢病毒载体构建等多项载体构建项目。
LIC克隆是根据同源重组的基本原理,在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列,利用ExoIII核酸外切酶的3′-5′外切酶活性切割待插入片段以及线性载体的末端从而产生单链突出,两者在体外条件下孵育,互补的粘性末端退火形成环状分子,经转化进大肠杆菌细胞后,细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子,达到基因克隆的目的。
服务流程:

服务周期:10-15个工作日
结果展示:
1、用经典连接方法和LIC法将人源基因(PRAK)和载体(pBOB-CMV)连接后导入大肠杆菌感受态的克隆效率对比,结果如下:


A



图A.采用LIC所获得克隆;



B



图B .采用经典连接方法所获得的克隆


2、以人源基因(PRAK)为例和载体(pBOB-CMV)为例,酶切检测LIC和经典连接方法获得的克隆。

图A .LIC单克隆酶切检测结果;图B .经典连接方法单克隆酶切检测结果;(*标注的为阴性克隆)。


载体类型:

载体类型

载体名称

载体类型

载体名称

哺乳动物表达载体

pcDNA3.3 CS2.0、pcDNA3.3 CS2.0 N-Flag/3HA/ Myc、pcDNA3.3 CS2.0 C-Flag/Myc、Pegfp-C1/N1

慢病毒哺乳动物表达载体

plv-EF1-puro CS2.0、plv-EF1-puro cs2.0 N-Flag/3HA/Myc、plv-EF1-puro cs2.0、C-Flag/3HA/Myc、plv-N-Flag-mCherry-IRES-puro

原核表达载体

pET-28a/22b/32m

荧光素酶报告基因载体

pGL4.18、pGL4.74、pmirGLO

无细胞表达载体

pTNT vector

shRNA载体

pSUPER

CRISPR/Cas9载体

慢病毒CRISPR/Cas9载体


客户提供材料:目的序列信息及载体信息
交付材料:电子版实验报告及测序结果;目的质粒200μl,对照质粒200μl。

服务说明:若非常见载体,可由客户提供。